[화실] 실험06 - 캐털레이즈의 반응속도
1. Introduction
1.1 실험 동기 및 목적
본 실험에서는 과산화수소의 농도를 달리하여 감자 즙 효소를 이용한 반응을 실험하여 이 때의 반응속도를 측정한다. 이를 통하여 기질과 촉매의 반응속도에 관한 식인 마이클리스-멘텐(Michaelis-Mentin) 식과 Lineweaver-Burk Equation을 그려보고 이를 통해 반응속도로 이루어진 상수인 Michaelis 상수 $K_{M}$과 최대 반응속도 $V_{max}$를 구하였다. 효소와 기질의 반응에 대한 과정 전반과 반응속도론에 대한 이해를 실험을 통하여 체득할 수 있다.
1.2 이론적 배경
1.2.1 효소(Enzyme)
효소란, 반응이 일어나는 주머니와 같은 활성 자리를 가진 거대 단백질 분자이다. 이 효소의 작용을 받는 분자인 기질(substrate)은 열쇠가 자물쇠에 들어맞듯이 활성 자리 주머니에 정확히 맞추어 결합하게 된다. 자물쇠와 정확히 맞는 열쇠만이 결합할 수 있는 것처럼 효소 또한 특정 기질과만 결합하려는 기질 특이성을 가지고 있다. 그런데 고정되어 있는 자물쇠와는 달리 효소 단백질 분자는 기질이 효소와 결합함에 따라 그 형태가 살짝 변형되는데, 이 때 효소 분자가 얼마나 기질에 맞게 변형되는지가 기질특이성의 세기를 결정한다. 이는 원래 효소 작용에서 처음 제시되었던 자물쇠-열쇠 모형을 보완, 수정한 유도 적합 매커니즘(induced-fit mechanism)이다[1].
Figure 1, 2. 전형적 효소 분자 / 효소 작용에 대한 자물쇠-열쇠 이론[1]
1.2.2 효소와 기질의 작용
Figure 1과 같이 효소는 실과 나선 형태가 얽힌 매우 복잡한 구조의 단백질이다. 이로 인해 효소와 기질이 결합할 수 있는 특정한 3차원적 구조를 결합 부위(binding site)라고 한다. 또한 앞서 언급하였던 특이성(specificity)는 특정한 반응에 대해서만 촉매가 작용하는, 즉 특정 기질에 대해서만 촉매가 반응한다는 사실을 알려준다. 기질은 효소와 결합하여 반응이 일어나는데, 이 때 효소와 기질이 결합된 결합체를 효소-기질 복합체(Enzyme-Substrate Complex)라고 불리며, 효소와 기질은 모두 결합과 분해가 가능하여 정반응과 역반응이 가능한 데 반해, 효소 기질 결합체에서 생성물로 돌아가는 반응은 비가역이기 때문에 이를 종합하여 다음과 같은 식을 세울 수 있다.
\[\begin{aligned} k_{1} k_{2} \\ E+S ⇄ ES → E+P \\ k_{-1} \end{aligned}\tag{1}\]$k_{1}, k_{2}, k_{-1}$은 모두 각 화살표 방향에 대한 속도상수를 의미한다. 즉 앞서 설명하였듯이 효소와 기질이 결합하여 효소-기질 복합체가 되는 것은 역반응이 일어날 수 있으나, 효소-기질 복합체가 생성물로 변하는 반응은 역반응이 거의 일어나지 않아 한쪽 반응만을 고려해도 된다.
1.2.3 마이클리스-멘텐(Michaelis-Menten) 식
마이클리스-멘텐 식은, 효소와 기질의 반응에서 반응속도 식과 정류상태 근사법을 사용하여 기질의 몰농도에 따른 초기 반응속도를 수식화하여 나타낸 것이다. 마이클리스-멘텐 식을 유도하는 데에는 기본적으로 ‘정류 상태(Steady state)일 때 반응물과 생성물의 속도는 변하지만 그 중간 물질의 농도는 일정하다는 법칙을 이용하게 된다. 먼저 속도상수의 정의를 이용하여 $k_{1}, k_{2}, k_{-1}$에 해당하는 단일 단계 반응의 식을 기술해 보자.
\[\frac{d\left[ES\right]}{dt}=k_{1}\left[E\right]\left[S\right]\tag{2}\] \[-\frac{d\left[ES\right]}{dt}=k_{-1}\left[ES\right]+k_{2}\left[ES\right]\tag{3}\]식 (2)와 식 (3)은 중간 물질인 효소-기질 복합체의 생성속도와 분해속도로, 식 (1)로부터 간단히 유도된다. 또한, 효소의 전체 양은 반응 과정에서 불변한다. 다시 말하면, 초기에 효소가 기질과 하나도 결합하지 않았을 때 효소의 몰농도를 $\left[E\right]_{0}$ 라 하면, 이는 반응 중 기질과 결합하지 않은 효소의 농도인 $\left[E\right]$와, 기질과 결합하여 효소-기질 복합체를 이루고 있는 $\left[ES\right]$의 합과 같다. 즉, $\left[E\right]_{0}=\left[E\right]+\left[ES\right]$이다. 이를 [E]에 대해 정리하여 식 (2)에 대입하면, 식 (2)는 다음과 같이 바뀐다.
\[\frac{d\left[ES\right]}{dt}=k_{1}(\left[E_{0}\right]-[ES])\left[S\right]\tag{4}\]여기서 모든 식은 반응 중간물질인 효소-기질 복합체의 시간당 농도변화율을 나타내고 있는데, 이는 정류상태 근사법에 의해 중간물질의 반응속도는 0이다. 이는 모든 반응에서 특별히 느린 반응이 없이 모두 그 속도가 비슷하기 때문에 사용할 수 있다. 이를 적용하면, 식 (3)과 (4)의 값은 동일하다. 이를 [ES]에 대하여 정리하면,
\[\left[ES\right]=\frac{\left[E\right]_{0}\left[S\right]}{(K_{M}+\left[S\right])} , K_{M}=\frac{k_{-1}+k_{2}}{k_{1}}\tag{5}\]효소-기질 복합체의 농도를 효소의 원래농도, 기질의 농도 그리고 마이클리스 상수인 $K_{M}$으로만 표현하였다. 이 때 마이클리스 상수는 속도상수들의 곱과 비율로 이루어져 있는, 동일 온도, 동일 효소와 기질에 대해서 고정된 상수 값이다.
마지막으로, 효소 반응에서의 속도는 $k_{2}$에 의해 결정되므로, 이 때의 속도를 V라 하면,
\[V=\frac{d\left[P\right]}{dt}=k_{2}\left[ES\right]\tag{6}\]식 (6)과 같이 V가 표현된다. 한편, 기질의 농도가 효소의 농도보다 일반적으로 매우 커 모든 효소가 효소-기질 복합체로 존재한다면 이 때의 속도가 최대이므로, 이 최대속도를 $V_{Max}$라 하면, 이 또한 다음과 같이 표현된다.
\[V_{Max}=k_{2}\left[E\right]\tag{7}\]식 (6), (7), (5)를 연립하여 기질의 농도가 특정 값으로 주어졌을 때의 초기 반응 속도에 관한 식으로 나타내면, 마이클리스-멘텐 식을 얻을 수 있다.
\[V=\frac{V_{Max}\left[S\right]}{(K_{M}+\left[S\right])}\tag{8}\]이 때 최대 속력의 절반에 해당하는 속력에 대한 기질의 농도를 Km이라 한다.
1.2.4 라인위버-버크 식 (Lineweaver-Burk equation)
Michaelis-Menten 식이 실험적으로 분석하기에는 곡선의 형태가 알맞지 않다. 그렇기에 속도에 역수를 취하여 속도의 역수가 기질의 역수에 대한 일차함수의 관계를 갖도록 하여 시각화와 분석에 이점이 있는 식을 라인위버-버크 식이라 한다. 이는 마이클리스-멘텐 식에 역수를 취하여 이를 1/V, 1/[S]에 관한 함수로 만들어준 것이다.
\[\frac{1}{V}=\left(\frac{K_{M}}{V_{Max}}\right)\left(\frac{1}{\left[S\right]}\right)+\frac{1}{V_{Max}}\tag{9}\]
[2]
Figure 3,4. Michaelis-Menten 식과 Lieneweaver-Burk 식의 그래프
2. Methods and Experiments
2.1 실험 준비물
30% 과산화수소수, 감자 즙, ice bath, 천, 갈판, 250mL 삼각플라스크 7개, 매스실린더, 증류수, 열 교반기, 물중탕용 비커, 기체 압력계, 시험관, 얼음, 피펫 (2mL, 5mL), 5N NaOH 수용액
2.2 실험 방법
2.2.1 과산화수소 농도별로 시간에 따른 압력 측정
- 먼저 갈판에 천을 덧대어 감자를 갈아 즙을 내준다. 감자 즙을 천으로 싸서 비커에 짜서 대략 20mL 정도의 감자 즙을 얻는다. 효소이므로 ice bath에서 차갑게 온도를 유지해준다.
- 과산화수소수 30%를 이용하여 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 6%의 과산화수소수 용액을 제조한다. 이를 각각 20mL 만든다.
- control로 효소를 변성시킨 대조군을 만들기 위해 6%의 강염기를 효소에 처리한다.
- 압력계의 <범위> 버튼을 눌러 영점을 맞추고 압력 측정을 시작한다. 갈아 만든 감자즙 2mL씩 각 농도의 과산화수소수 20mL가 들어있는 삼각 플라스크에 넣고 빠르게 압력 측정장치로 밀봉하여 시간에 따른 압력변화를 측정한다.
2.2.2 압력 변화 데이터의 처리
- 초기 상태에서 시간이 지남에 따라 내부 압력이 어떻게 변하였는지 그 압력차를 생성된 산소의 몰농도로 변환하기 위해서는 이상기체 상태방정식인 PV=nRT를 활용하여야 한다. 이 때 이상기체 상태방정식에서 부피인 V, 기체상수 R, 온도 T는 상수이며 생성된 기체의 몰수에 따라 압력만 변하는 일차함수의 형태가 된다.
- 실험 데이터를 통해 얻어지는 hPa 단위의 압력을 P에 대입, V는 플라스크의 부피인 288mL로부터 액체의 부피인 22mL를 뺸 266mL를 L, 혹은 m^3 단위로 변환하여 대입, R은 단위에 맞게 0.082나 8.314를 선택하여 대입, 온도는 섭씨 25도로 일정하였으로 켈빈 단위의 온도인 298K를 대입하여 몰농도의 변화를 구한다.
3. Results and Discussion
3.1 실험 데이터
3.1.1 과산화수소수 퍼센트 농도를 기질의 농도 [S]로 변환
1% 과산화수소수를 먼저 고려해 보자. 과산화수소수의 농도는 퍼센트 농도 단위이므로, 이를 몰농도 단위인 [S]로 변환하는 과정을 거친다. 과산화수소의 밀도가 1$g/m^{3}$로 주어졌으므로, 질량 퍼센트를 바로 부피 퍼센트로 변환할 수 있다. 본 실험에서는 감자즙까지 포함하여 총 22mL의 액체 용액이 있으므로 순수한 과산화수소는 0.22mL, 0.22g인 것을 알 수 있다. 과산화수소의 몰질량은 34.01g/mol이므로, $6.4686\times 10^{-3}mol$의 과산화수소가 22mL속에 들어있는 것이므로 이를 마지막으로 몰농도로 변환해주면 $\left[S\right]=0.2940mol/L$ 라는 결과를 얻을 수 있다. 위 과정에서는 1% 과산화수소수의 몰농도를 구하였지만, 과산화수소의 비중이 1임을 감안하면 n%의 과산화수소수의 몰농도는 1% 과산화수소수에서 구한 몰농도에 n을 곱해주면 된다는 사실을 알 수 있다. 즉 0.5, 1, 2, 3, 4, 6% 과산화수소수 용액의 몰농도는 각각 다음과 같다.
| % 농도 | 0.5 | 1 | 2 | 3 | 4 | 6 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 몰농도[mol/L] | 0.1470 | 0.2940 | 0.5880 | 0.8820 | 1.1760 | 1.7640 |
undefined Table 1. 과산화수소수의 %농도를 mol 농도로 변환
3.1.2 압력변화 데이터 처리 과정 (압력변화를 몰수 변화로 변환)
먼저, 대조군을 포함한 모든 실험에서 V, R, T의 상수의 값이 동일하므로 이를 하나의 식으로 공식화할 수 있다. 식 (10)을 베이스로 이미 계산된 값을 대입하여 식을 만들었다.
\[\begin{aligned} V=2.66\times 10^{-4}m^{3}, R=8.314m^{3}⋅Pa⋅mol^{-1}K^{-1}, T=298K \\ \Delta n=4.88\times 10^{-4}\Delta P [mol/L] \end{aligned}\tag{11}\]일반성을 잃지 않고 식 (11)을 그래프에 대입하여 모든 경우에 대해 시간당 생성물의 몰수로 변환할 수 있으며, 이 때 몰수를 다시 액체 속에서의 몰농도 [P]로 변환시켜주어야 한다.
\[H_{2}O_{2}→H_{2}O+\frac{1}{2}O_{2}↑\tag{12}\]과산화수소의 밀도 또한 물과 동일하게 1$g/m^{3}$으로 주어졌으므로 식 (12)의 반응 전후 삼각 플라스크 속 액체의 부피와 밀도는 동일하다고 간주할 수 있다. 또한 식 (12)로부터 반응식에서 과산화수소와 생성되는 산소의 몰수비가 2:1임을 통해 산소의 생성속도의 2배가 과산화수소의 반응속도와 같다는 사실을 알 수 있다. 몰수 변화량에 부피인 22mL로 나누어 특정 시간에서의 몰농도를 구하였다. 시간대별 몰농도를 먼저 그래프로 표현하여 그 경향성을 확인해 보았다.
Figure 5. 농도별 시간에 따른 산소의 몰농도 그래프
Figure 5를 통해 처음 기질의 농도에 따라, 그리고 시간에 따라 생성되는 산소의 양을 알 수 있다. 기질의 농도가 높을수록 시간당 생성되는 산소의 양이 높은 것을 알 수 있으며, 모든 그래프의 기울기가 직선의 형태로 나타난다는 사실을 알 수 있다. 이를 통해 원점을 지나는, 즉 절편이 모두 0인 직선으로 선형회귀 하였을 때 그 기울기를 산소의 생성속도로 활용할 수 있을 것이다. 반면 6% 강염기를 처리한 대조군의 경우 그래프의 기울기가 거의 0임과 동시에 오히려 부피가 감소하는 것을 확인할 수 있다.
| % 농도 | 0.5 | 1 | 2 | 3 | 4 | 6 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 몰농도[mM] | 0.1824 | 0.4386 | 0.6293 | 0.6822 | 0.8397 | 0.8577 |
undefined Table 2. % 농도에 따른 초기 반응속도 (mmol/s)
Table 1과 Table 2의 결과를 종합하여 Michaelis-Menten 식과 Lineweaver-Bulk plot을 그리기 위한 데이터를 모두 정리한 것은 Table 3와 같다.
| S | S | 1/S | v(mol/sec) | 1/v(sec/mol) |
|---|---|---|---|---|
| 0.5 | 0.1470 | 6.8027 | $1.824\times 10^{-4}$ | 5482.456 |
| 1 | 0.2940 | 3.4014 | $4.386\times 10^{-4}$ | 2279.982 |
| 2 | 0.5880 | 1.7007 | $6.293\times 10^{-4}$ | 1589.067 |
| 3 | 0.8820 | 1.1338 | $6.822\times 10^{-4}$ | 1465.846 |
| 4 | 1.1760 | 0.8503 | $8.397\times 10^{-4}$ | 1190.902 |
| 6 | 1.7640 | 0.5669 | $8.577\times 10^{-4}$ | 1165.909 |
undefined Table 3. 그래프 Plotting을 위한 데이터
3.1.3 (1) Michaelis-Menten 그래프 그리기
먼저 실험 데이터를 통해 마이클리스-멘텐 식을 구하기 위해서는 실험 데이터와 이를 바탕으로 구해진 이론적 M-M 식의 오차가 최소가 되도록 만들어야 한다. 즉 마이클리스-멘텐의 이론식에서 Vmax와 KM을 변수로 보고 실험값들을 대입하였을 때 오차의 제곱을 최소로 만드는 Vmax와 KM을 채택하는 것이 합당하다. 그런데 마이클리스-멘텐 식은 비선형, 그 중에서도 유리함수이기 때문에 excel이나 손으로 계산하는 것이 불가능하다. 이를 계산하기 위해 Python scipy의 curve_fit 라이브러리를 사용하여 가장 합당한 곡선을 찾아 최적화하는 데에 성공하였다.
Figure 6(좌측). Michaelis-Menten 식을 최소제곱법을 적용하여 실험 데이터를 이용해 Fitting한 그래프
Figure 7(우측). 오차가 가장 큰 4% 데이터를 제거한 뒤 Fitting한 그래프
이 때 변수인 Vmax와 KM의 값을 최소제곱법을 이용해 구한 값은 Figure 6의 아래에 표기된 것과 같다. 또한, 가장 실험값과 M-M 식의 차이가 큰 4% 농도일 때의 데이터를 제외하고 그래프를 그려서 Vmax와 KM을 구하였다. 이들을 조금 더 쉬운 fitting 방법인 Lineweaver-Burk plot에서 구한 값들과 비교하고자 한다.
3.1.4 (2) Lineweaver-Burk 그래프 그리기
Figure 8(좌측). Lineweaver-Burk 식을 최소제곱법을 적용하여 실험 데이터를 이용해 Fitting한 그래프
Figure 9(우측). 가장 오차가 큰 4% 데이터를 제외하고 fitting한 그래프
Lineweaver-Burk 식의 경우 일차함수이므로 추세선을 구하는 것과 같은 방법으로 일차함수에 근사하여 이를 그래프로 구하였다. 이 때 이론적 배경에서 기술한 것과 같이 기울기는 KM/Vmax이며, Y절편은 1/Vmax, X절편은 -1/KM이므로 이를 이용하여 구한 Vmax값과 KM값을 각 figure 아래에 표기하였다. 이 때 회귀 직선의 식은 다음과 같다.
\[y=689.809x+519.612\tag{13}\]X절편의 값은 -0.7533이며, 이는 식 (9)에 따라 $-\frac{1}{K_{M}}$을 뜻한다. 또한 y절편의 값은 519.612로 그 값 또한 식 (9)에 따라 $\frac{1}{V_{max}}$를 뜻한다. 마지막으로 기울기 값은 689.809이며 그 의미는 마이클리스 상수와 최고속도의 비율인 $\frac{K_{M}}{V_{max}}$를 뜻한다.
3.2 실험 결과 분석
3.2.1 각 분석방법 별 KM값과 Vmax 값 분석
3.1.3의 Michaelis-Menten 식을 통해 도출된 최대 초기 속도와 마이클리스 상수는 각각 0.001204과 0.6149이었으며, Lineweaver-Burk 그래프를 통해 구한 Vmax와 KM은 각각 0.00162, 1.1735로 Vmax는 비슷하나 KM의 경우 꽤 큰 차이를 보였다. 이러한 차이를 보이는 가장 큰 이유는, 실험 데이터를 통해 구하게 되는 변수 값이 서로 다르기 때문이다. Michaelis-Menten 식에서는 Vmax와 Km값을 직접 변수 a와 b로 지정하여 구하였으며, Lineweaver-Burk 식에서는 기울기와 y절편을 a와 b로 놓고 선형 회귀하였기 때문에 이러한 요인에 의해 두 식으로부터 유도되는 Vmax와 KM 값이 다른 것이다. 추가적으로 근사 방법에 있어서 x나 y의 값이 0에 매우 가깝지 않은 이상 선형 근사의 방법이 더 정확하다고 볼 수 있다. 데이터를 fitting할 때 M-M식에 직접 fitting함에 어려움이 있기에 역수를 취해 일차함수에 대응시키는 Lineweaver-Burk식이 고안된 것이기 때문이다.
3.2.2 오차를 유발하는 요인의 분석
오차 요인에 대한 분석과 그 오차를 줄이기 위한 개선 방법을 논의하기 위해서는 실험 과정을 따라 각각의 요인들을 찾을 수 있다.
먼저 과산화수소의 % 농도를 몰농도로 변환하는 과정에서 발생할 수 있는 오류는, 부정확한 밀도의 계산이다. 계산의 편의상 과산화수소의 농도를 1g/cm^3으로 가정하였지만, 실제 순수한 과산화수소의 농도는 1.45g/cm^3으로 차이가 있다. 추가적으로 효소, 전분 및 기타 성분이 포함된 감자 즙을 넣었기 때문에 물의 비중인 1이 아니라 더 큰 값으로 상정하고 계산해야만 정확한 값을 얻을 수 있다.
또, PV=nRT, 이상기체 상태방정식을 적용하는 과정에서 기체가 차지하는 부피의 결정에서 오차가 발생하였을 가능성이 있다. 삼각 플라스크 내부의 자체부피인 288mL에서 용기 속 액체의 부피인 22mL를 뺀 266mL를 부피로 설정하고 이상기체 상태방정식에 대입했으나, 압력을 측정하는 장치가 플라스크 내부로 들어가는 구조이기 때문에 실제 부피는 더 작을 것이다. 또한 밀봉하는 과정에서 공기가 세어나갔을 가능성, 감자 즙을 넣고 밀봉하기 직전까지 생성된 산소가 유출된 양 등을 고려하면 상대적으로 부정확한 부피, 압력 데이터가 결과에 반영되었음을 알 수 있다. 이를 더 정확히, 측정하기 위해서는 수상치환 장치와 압력은 1기압으로 유지하되, 반응에서 생성되는 기체의 실시간으로 확인할 수 있게 만든다면 더 정확한 데이터를 얻어낼 수 있을 것이다. 그러나 이 방법 또한 산소가 물속에서 잘 용해되므로 더 나은 방법을 모색해야 함을 알 수 있다.
3.2.3 대조군의 실험결과에 대한 고찰
대조군은 다른 case들과 다르게 산소가 생성되지 않아 압력이 증가하지 않았다. 이는 생체 촉매인 효소가 일종의 단백질이기 때문에 강염기 환경 아래에서 변성이 일어났기 때문이다. 효소의 구조는 가열하거나 화학적 변성 물질에 노출될 때 그 접힘이 풀리며 변성이 일어나고, 이러한 파괴는 보통 효소 활성의 소실을 야기한다. 또한 효소는 특정 온도 이상에서 변성이 일어나는 경우가 많아 최적 온도와 관련이 있는 경우가 많다[3].
4. Conclusion
실험을 통해 서로 다른 농도의 과산화수소수에 감자 즙을 넣어 효소에 의한 촉매 반응을 정량적으로 확인하였다. 시간에 따라 발생하는 산소 기체의 양을 압력변화를 측정하여 이상기체 상태방정식을 통해 알아냈으며, 이를 그래프로 도식화하고 추세선의 기울기를 통해 초기 반응 속도를 알아내었다. 실험을 통해 얻어낸 데이터를 통해 효소에 대한 반응속도 이론인 마이클리스-멘텐 식에 대입하여 최대 속도와 마이클리스 상수를 각각 0.0012와 0.6149로 구하였으며, 마이클리스-멘텐 식의 양변에 역수를 취하여 y=ax+b 형태의 선형회귀 모델을 통해 분석할 수 있는 Lineweaver-Burk 식으로 대입하여 최대 속도와 마이클리스 상수를 각각 0.001650와 1.1735라는 값을 얻을 수 있었다. 또한 Lineweaver-Burk 식에서의 x절편, y절편 그리고 기울기가 의미하는 바를 식 유도를 통해 확인하였으며, 실험의 오차 요인을 잘못된 압력과 부피의 측정에서 찾고 실험 개선 방안에 대해 제언하였다.
5. Assignment
5.1 대조군 실험 결과의 의미를 효소의 특성과 연관지어서 설명하시오.
앞서 언급하였듯이 효소는 여러 단백질들이 모여 만들어진 것으로 이들이 서로 사슬처럼 연결되어 있기 때문에 강염기 환경에서는 변성이 일어나 제대로 촉매의 역할을 하지 못하였기 때문에 이러한 결과를 초래했다고 볼 수 있다. 효소는 보통 높은 온도, 화학적 변성 물질에 노출될 때 그 접힘이 풀리며 변성이 일어나게 된다. 변성에 의한 파괴는 보통 효소 활성, 즉 효소의 촉매 작용의 활성을 소실시킨다. 이로 인해 6% 강염기에 감자 즙을 처리하면 효소가 모두 그 구조의 변성이 일어나 제대로 촉매의 역할을 수행하지 못하는 것이다.
5.2 마이클리스-멘텐 관련 아래 식들의 유도 과정을 서술하시오.
(앞의 이론적 배경에서 가져옴)
마이클리스-멘텐 식은, 효소와 기질의 반응에서 반응속도 식과 정류상태 근사법을 사용하여 기질의 몰농도에 따른 초기 반응속도를 수식화하여 나타낸 것이다. 마이클리스-멘텐 식을 유도하는 데에는 기본적으로 ‘정류 상태(Steady state)일 때 반응물과 생성물의 속도는 변하지만 그 중간 물질의 농도는 일정하다는 법칙을 이용하게 된다. 먼저 속도상수의 정의를 이용하여 $k_{1}, k_{2}, k_{-1}$에 해당하는 단일 단계 반응의 식을 기술해 보자.
\[\frac{d\left[ES\right]}{dt}=k_{1}\left[E\right]\left[S\right]\] \[-\frac{d\left[ES\right]}{dt}=k_{-1}\left[ES\right]+k_{2}\left[ES\right]\]식 (2)와 식 (3)은 중간 물질인 효소-기질 복합체의 생성속도와 분해속도로, 식 (1)로부터 간단히 유도된다. 또한, 효소의 전체 양은 반응 과정에서 불변한다. 다시 말하면, 초기에 효소가 기질과 하나도 결합하지 않았을 때 효소의 몰농도를 $\left[E\right]_{0}$ 라 하면, 이는 반응 중 기질과 결합하지 않은 효소의 농도인 $\left[E\right]$와, 기질과 결합하여 효소-기질 복합체를 이루고 있는 $\left[ES\right]$의 합과 같다. 즉, $\left[E\right]_{0}=\left[E\right]+\left[ES\right]$이다. 이를 [E]에 대해 정리하여 식 (2)에 대입하면, 식 (2)는 다음과 같이 바뀐다.
\[\frac{d\left[ES\right]}{dt}=k_{1}(\left[E_{0}\right]-[ES])\left[S\right]\]여기서 모든 식은 반응 중간물질인 효소-기질 복합체의 시간당 농도변화율을 나타내고 있는데, 이는 정류상태 근사법에 의해 중간물질의 반응속도는 0이다. 이는 모든 반응에서 특별히 느린 반응이 없이 모두 그 속도가 비슷하기 때문에 사용할 수 있다. 이를 적용하면, 식 (3)과 (4)의 값은 동일하다. 이를 [ES]에 대하여 정리하면,
\[\left(k_{-1}+k_{2}\right)\left[ES\right]=k_{1}\left(\left[E\right]_{0}-\left[ES\right]\right)\left[S\right],\] \[\left(k_{-1}+k_{2}+k_{1}[S]\right)\left[ES\right]=k_{1}\left[E\right]_{0}[S]\] \[\left[ES\right]=\frac{k_{1}\left[E\right]_{0}\left[S\right]}{\left(k_{-1}+k_{2}+k_{1}[S]\right)}=\frac{\left[E\right]_{0}\left[S\right]}{\left(\frac{k_{-1}+k_{2}}{k_{1}}+[S]\right)}\]$\left[ES\right]=\frac{\left[E\right]_{0}\left[S\right]}{\left(K_{M}+\left[S\right]\right)}$ , $K_{M}=\frac{k_{-1}+k_{2}}{k_{1}}$(2-1)
효소-기질 복합체의 농도를 효소의 원래농도, 기질의 농도 그리고 마이클리스 상수인 $K_{M}$으로만 표현하였다. 이 때 마이클리스 상수는 속도상수들의 곱과 비율로 이루어져 있는, 동일 온도, 동일 효소와 기질에 대해서 고정된 상수 값이다.
마지막으로, 효소 반응에서의 속도는 $k_{2}$에 의해 결정되므로, 이 때의 속도를 V라 하면,
\[V=\frac{d\left[P\right]}{dt}=k_{2}\left[ES\right]\]식 (6)과 같이 V가 표현된다. 한편, 기질의 농도가 효소의 농도보다 일반적으로 매우 커 모든 효소가 효소-기질 복합체로 존재한다면 이 때의 속도가 최대이므로, 이 최대속도를 $V_{Max}$라 하면, 이 또한 다음과 같이 표현된다.
\[V_{Max}=k_{2}\left[E\right]\]식 (6), (7), (5)를 연립하여 기질의 농도가 특정 값으로 주어졌을 때의 초기 반응 속도에 관한 식으로 나타내면, 마이클리스-멘텐 식을 얻을 수 있다.
$V=\frac{V_{Max}\left[S\right]}{(K_{M}+\left[S\right])}$ (2-2)
이 때 최대 속력의 절반에 해당하는 속력에 대한 기질의 농도를 Km이라 한다.
5.3 항생제는 박테리아를 죽이는 물질인데 세포 내 효소를 억제하는 전략을 이용하는 경우가 많다. (중략)
- 이 그림들을 참고하여 sulfonamide가 박테리아를 죽이는 과정에서 효소, 기질, 억제제가 무엇이며, sulfonamide는 어떻게 박테리아를 죽일 수 있는 것인지 추측 해보시오.
먼저 효소는 Dihydropteroate synthase, 기질은 PABA, 억제제는 sulfonamide이며, 이 항생제는 세포내 아미노산에 필요한 Tetrahydrofolic을 만들기 위해 PABA를 촉매 Dihydropteroate synthase를 이용하여 Dihydropteroic acid로 만드는 과정을 경쟁적 억제제로 작용하여 이를 저해한다. 즉, 효소와 기질의 결합 부위에 Sulfonamide 또한 결합하여 PABA가 효소와 결합해 효소-기질 복합체를 형성하고 생성물이 되는 비율을 줄이는 방법으로 Tetrahydrofolic acid의 합성을 방해한다. 이렇게 아미노산을 만들기 위한 성분의 합성을 방해받은 박테리아는 아미노산 합성에 장애를 입고 박테리아를 죽이게 된다.
- 그렇다면 (a)에서 찾은 이 효소에 sulfonamide를 첨가할 경우에 KM과 Vmax는 어떻게 변화할지 예측하고 그 근거를 설명하시오
sulfonamide를 첨가하면 KM은 증가하며, Vmax는 일정하다.
정성적으로 Vmax가 일정함을 보일 수 있는 방법은, 저해제가 일정하다는 가정 하에 기질의 농도를 충분히 크게 늘리면 그 비율의 측면에서 저해제보다 기질이 압도적으로 많으므로 저해제의 효과가 미미하게 되어 Vmax는 변하지 않음을 알 수 있다. 같은 방법으로 마이클리스-멘텐 식에서 Vmax가 일정하므로, 임의의 [S]값을 대입했을 때 저해제를 넣지 않은 경우보다 반응속도를 늦추려면 KM이 커지는 방법밖에 없다.
정량적으로 이를 설명하자면, 기존의
\[k_{1} k_{2}\] \[E+S ⇄ ES → E+P\] \[k_{-1}\]식에 E와 저해제가 결합하는 두번째 식을 세우고 이를 빠른 평형 가정하에 식을 세우면 된다.
\[E+I ⇄ EI\]$K_{1}$ (평형상수)
이 때 K1의 정의, $K_{1}=\frac{\left[E\right]\left[I\right]}{[EI]}$로부터 $\left[E\right]_{0}=\left[E\right]+\left[ES\right]+[EI]$를 알 수 있으며, 이를 적용하면, 경쟁 적 저해제서의 k값, k’은$k_{M}^{‘}=k_{M}(1+\frac{\left[I\right]}{K_{1}})$이 되고, 이를 다시 마이클리스-멘텐 식으로 변환하면,
\[V'=\frac{V_{Max}\left[S\right]}{(K_{M}(1+\frac{\left[I\right]}{K_{1}})+\left[S\right])}\]이 되어, 저해제가 존재하지 않을 때의 KM 값에 비하여 증가하며, Vmax는 아무 영향이 없음을 정량적으로 증명할 수 있다[4].
6. Reference
[1] Peter Atkins, Loretta Jones, Leroy Laverman. “Chemical Principles – The Quest for Insight” 7th edition. (Korean Ver.) 7E.3 “생체 촉매: 효소”, figure : p. 669
[2] figure : Wikipedia (Ko), “미카엘리스-멘텐 속도론”, ”라인위버-버크 방정식” Archived 10. Nov, 2021.
[3] Petsko GA, Ringe D (2003), “Protain structure and function” London:New Science p.27
[4] Price, NC. (1979) “What is meant by ‘competitive inhibition?” (Trends in Biochemical Sciences)