[화실] 실험04 - 지시약의 pKa
1. Introduction
1.1 실험 동기 및 목적
본 실험에서는 지시약의 pKa를 결정하는 것을 목표로 분광광도계를 통해 지시약과 그 짝염기의 농도의 비율을 결정하고, 이를 Henderson-Hasselbalch 식(이하 H-H 식)에 대입하여 pKa를 최종적으로 구해낼 것이다. 여러 pH 농도하의 실험을 통해 pH 농도에 관계없이 지시약의 산해리상수가 일정하다는 것을 보일 것이다. 또한 지시약의 농도를 바꾸어 가며 실험을 진행하여 흡광도가 용액의 몰농도와 비례한다는 Beer-Lambert 법칙을 증명해 보는 것 또한 이번 실험의 목적이다.
2. Theory
2.1 이론적 배경
2.1.1 분광광도계
분광광도계란, 빛을 시료에 투과하여 투과 전후의 파장대별 빛의 세기 차이를 측정하고 시료가 어느 파장대의 빛을 얼마나 흡수하였는지를 측정하는 장비이다. 흡수하는 주요 파장은 물질마다 상이하므로, 파장을 측정함으로써 시료에 특정 물질이 포함되었는지의 여부를 정성적으로 파악할 수 있으며, 특정 파장의 빛의 세기를 비교해 봄으로써 해당 시료가 얼마나 포함되었는지를 확인할 수 있다. 이러한 분광광도계는 광원(Light Source)로부터 방출되는 비의 흐름에 따라 단색화장치(Monochromator), 파장 선택기(Wavelength selector), 시료(Sample), 검출기(Detector)를 거쳐 가공할 만한 실험 결과를 보여주게 된다.
Figure 1. 분광광도계의 대략적 구조
먼저 Light Source, 즉 광원은 분광광도계에서 필요로 하는 빛을 만들어주는 장치로, 주로 중수소(D2)를 이용하는 아크 램프나 텅스텐(W) 램프를 분광광도계에 사용한다. 광원의 종류에 따라 발산하는 파장의 종류가 상이하며, 주로 아크램프의 경우 자외선을, 가시광선 영역에서는 텅스텐 램프를 사용한다.
다음으로 단색화 장치(Monochromator)는 광원에서 나오는 여러 파장대의 빛 중 특정 파장만을 시료로 통과시키는 장치이다. 주로 프리즘이나 회절 격자를 이용하여 단일 파장의 빛을 추출하는데, 최근에는 회절 격자를 이용한 장치가 많아지는 편이다. 여러 파장대의 빛을 시료에 통과시켜야 하므로 분광광도계에서는 아주 짧은 시간동안 특정 파장의 빛을 쏘고 측정한 뒤 다시 단색화 장치를 이용하여 파장을 바꾸어 다시 반복하는 방법으로 넓은 파장대를 모두 실험한다. 실험에 따라 다르지만 넓은 파장대에 대해 짧은 시간동안 빛을 노출시켜 흡광도를 구하는 실험과 같은 파장의 빛을 지속적으로 인가하며 시간에 따른 흡광도를 구하는 실험 등이 존재하므로 다양한 종류의 단색화 장치를 용도에 맞게 활용해야 한다.
시료 혹은 샘플은, 가로와 세로 길이가 각각 1cm인 직육면체 용기인 큐벳에 담기며, 이는 주로 플라스틱이나 유리 등을 이용하여 제작된다. 큐벳의 가로와 세로 길이가 1cm인 것은 후에 설명할 Beer-Lambert 법칙에서 빛이 통과한 거리를 항상 1cm로 고정하여 실험의 편의성을 더하기 위한 것으로, 보편적으로 1cm 길이의 큐벳이 사용된다. 큐벳의 벽면 부분으로 빛이 통과하여 흡광도를 측정하기 때문에 큐벳의 벽면에 스크레치가 날 경우 이로 인한 회절, 굴절 등의 광학적 효과가 생겨 오차의 원인이 되므로 주의하여 다루어야 한다.
마지막으로 검출기(Detector)는 시료를 통과한 빛의 세기를 검출하는 장치이다. 검출된 빛은 광전 증폭기(Photo Multiplier Tube)라고 불리는 장치를 거쳐 빛의 세기가 증폭된 뒤 광 다이오드(Photodiode)를 통해 그 빛의 세기가 측정된다. 이렇게 측정된 빛의 세기는 컴퓨터를 통해 기록되어 파장에 대한 빛의 세기 그래프로 변환된다.
분광 광도계를 통해 측정되는 빛의 세기는 다음과 같은 식들에 의해 정량화된다.
\[T=\frac{I}{I_{0}}, A=-log_{10}T=log_{10}\frac{I_{0}}{I}\tag{1}\]식 (1)에서 T는 시료를 통과한 빛의 세기에서 시료를 통과하기 전 빛의 세기를 나누어 준 것으로, T는 투과율(Transmittance)라고 부른다. 우리가 본 실험에서 알고자 하는 것은 흡광도(Absorbance)로, 이는 투과율에 역수를 취한 뒤 밑이 10인 로그를 취한 것이다. 흡광도 값이 높다는 것은 시료가 빛을 많이 흡수하여 시료를 통과한 빛의 세기가 약하다는 것이다. 반대로 시료가 빛을 전혀 흡수하지 않았다면, $I_{0}=I$가 되어 흡광도는 0이 될 것이다.
2.1.2 Beer-Lambert 법칙
Beer-Lambert 법칙은 용액에서의 빛의 투과율과 감쇄에 관한 법칙이다. 이 법칙은 앞서 언급한 흡광도가 몰농도와 빛의 투과 길이와 정비례하며, 물질 고유의 특성인 몰 흡광계수에 의해 좌우된다는 것을 설명한다.
\[A=\epsilon cl\tag{2}\]흡광도는 무단위수이므로 빛의 통과 길이에 해당하는 l의 단위로 cm를 사용하여 1cm의 큐벳에 대해 l=1로 고정하고 흡광도를 분석할 수 있다. 또한 c는 용액의 몰 농도가 된다. [3]
2.1.3 브뢴스테드 산과 염기
산, 혹은 염기는 시대와 학자에 따라 여러 정의가 존재했으며, 이러한 정의는 더 많은 물질들을 산과 염기로 정의하여 산과 염기의 범위를 확장하였다.
가장 먼저 아레니우스가 물에 녹였을 때 수소 이온(H+)를 내놓는 물질을 산이라고 정의하였다. 이는 현존하는 많은 산들에 대한 적합한 설명이 될 수 있으나, 수용액에서 일어나는 반응만을 설명할 수 있으며 암모니아와 같은 일부 염기를 정의하지 못한다는 단점이 있다.
이후, 화학자 브뢴스테드에 의해 브뢴스테드-로우리 산과 염기가 정의되었는데, 이는 반응에서 수소 이온의 이동을 통해 산과 염기를 정의하였다. 반응을 통해 다른 물질에 수소 이온을 제공하는 물질이 브뢴스테드 산, 수소 이온을 받는 물질을 브뢴스테드 염기라고 정의하였다. 다시 말하자면 브뢴스테드 산은 반응에서 양성자 주개, 브뢴스테드 염기는 양성자 받개의 역할을 수행하게 되는 것이다. 이러한 정의에 의하면 어떠한 반응의 정반응과 역반응에 대해서 생각해 보았을 때 반응물과 생성물 모두 산과 염기로 각각 정의되게 되는데, 이 때 반응 전후 산과 염기로 짝지어지는 관계를 짝산-짝염기 관계라고 한다. 암모니아와 물 분자의 반응을 통해 짝산 짝염기 관계를 확인해 보자.
\[H_{2}O+NH_{3}⇌OH^{-}+NH_{4}^{+}\tag{3}\]위 반응에서 물 분자는 암모니아에 수소 이온을 제공하여 수산화 이온이 되므로 브뢴스테드 산이며, 반대로 암모니아는 물 분자로부터 수소 이온을 받아 암모늄 이온이 되므로 브뢴스테드 염기이다. 이 때 생성물에서 수산화 이온은 물에 대한 짝염기가 되며, 암모늄 이온은 암모니아에 대한 짝산이 된다. 위 반응에서의 평형상수를 생각해 보았을 때 역반응과 정반응의 평형상수는 서로 역수 관계이므로, 산의 세기가 세다면 그 짝염기의 세기는 약하며, 염기의 세기가 세다면 그 짝산의 세기는 약하다는 관계를 찾을 수 있다.[1]
2.1.4 물의 자동 이온화와 pH
순수한 물은 전류가 통하지 않는다고 하는데, 이는 순수한 물 속에는 이온 상태의 물질이 거의 존재하지 않기 때문이다. 그러나 순수한 물에도 물의 자동이온화에 의해 하이드로늄 이온과 수산화 이온이 존재한다. 물의 자동이온화 반응은 다음과 같으며 평형상수는 Kw로 매우 작다.
\[2H_{2}O⇌OH^{-}+H_{3}O^{+}\tag{4}\]위 반응에서의 평형상수, Kw=[H+][OH-]로 섭씨 25도 기준 Kw=10-14로 정반응이 매우 일어나지 않는 반응 중 하나이다. 또한 앞선 2.1.3.의 브뢴스테드 산의 정의에 따라 수소 이온을 많이 내놓을수록 산의 세기가 강하기 때문에 화학종의 산의 세기를 나타내는 척도로 수소 이온의 농도 [H+]에 -log를 취한 값을 pH라 정의하게 된다. Kw=[H+][OH-] 이므로 25도 기준 pH+pOH=14라는 식을 만족하게 되며, 온도에 따라 pH와 pOH의 합은 달라지게 된다.[2]
2.1.5 산 이온화 상수 Ka와 pKa
앞서 물의 자동이온화에서의 반응과 동일하게, 산이 물에서 해리되는 반응에 대한 평형상수 식을 세워보자.
\[HA+H_{2}O⇌A^{-}+H_{3}O^{+}\tag{5}\]식 (5)에 대한 평형상수 식은 다음과 같다.
\[K=\frac{\left[A^{-}\right] [H_{3}O^{+}]}{\left[HA\right][H_{2}O]}\tag{6}\]물의 농도는 거의 일정하기 때문에 산의 종류에 따라 달라지는 농도들을 이용하여 산의 해리 상수 혹은 이온화 상수를 표현하면,
\[K_{a}=\frac{\left[A^{-}\right] [H_{3}O^{+}]}{\left[HA\right]}\tag{7}\]다음 식과 같이 표현된다. 식 (5)로부터 정반응이 더 활발하게 진행되면 식 (7)의 분모는 작아지고 분자는 커져 산 이온화 상수가 커지게 되므로, 더 강한 산일수록 Ka의 값이 크다.
2.1.6 Henderson-Hasselbalch 식
Henderson-Hasselbalch 식 혹은 헨더슨-하셀바흐 식은 완충용액으로서의 산을 표현하기 위해 만들어진 식으로 기존의 산의 해리상수의 표현식의 양변에 밑이 10인 로그를 취하여 간단히 유도된다.
\[\begin{aligned} log_{10}K_{a}=log_{10}\frac{\left[A^{-}\right] }{\left[HA\right]}+log_{10}[H_{3}O^{+}] \\ pH=pK_{a}+log_{10}\frac{\left[A^{-}\right] }{\left[HA\right]}=pK_{a}+log_{10}\frac{\left[Base\right] }{[Acid]} \end{aligned}\tag{8}\]수소 이온 혹은 하이드로늄 이온 농도에 -log를 취한 것이 pH임을 이용하여 정리하면 식 (8)과 같이 pH를 pKa와 산, 그 짝염기에 대한 식으로 나타낼 수 있다. 이 식이 의미하는 바는, Base와 Acid, 즉 짝산과 짝염기의 농도가 비슷할 때에는 용액에 산이나 염기가 추가되어도 그 용액의 pH가 크게 변하지 않는다는 것을 의미한다. 그 차이가 가장 적은 상태는 Base와 Acid의 농도가 동일한 지점, 즉 반당량점에서 pH와 pKa가 일치하며 완충용액의 성질을 띈다는 사실을 Henderson-Hasselbalch 식을 통해서도 추론할 수 있다. 본 실험에서는 pH가 이미 알려져있는 용액 속 산과 그 짝염기의 농도를 분광광도법을 통해 알아내고, 이를 통해 pKa를 추론하는 과정을 거친다. 또한 산과 염기가 첨가되어도 그 pH가 크게 변하지 않는 완충용액(Buffer)를 만들기 위해서는 산과 그 짝염기를 일정한 비율로 섞어 제작할 수 있음을 시사하고 있다. [4]
2.1.7 지시약 (Indicator)
지시약이란, pH에 따라 색이 변하는 화합물로, 이는 pH를 알아봐야 하는 산 염기 실험 뿐만이 아니라 다양한 분야에서 사용된다. 어떤 화합물의 색은 백색광이 입사되었을 때 해당 물질이 흡수하지 않고 반사하면서 나타나는 색을 의미하는데, 이것이 pH가 변함에 따라 달라진다는 것은 수소 이온이 분자의 구조를 바꾸어 잘 흡수하는/잘 흡수하지 못하는 파장대를 바꾸었기 때문이다. 지시약은 그 종류에 따라 다양한 변색 범위가 있는데, pH의 범위에 따라 색이 변하는 범위를 의미한다. 중화 적정이나 특정 반응에서 pH의 변화 범위를 고려하여 알맞은 지시약을 사용해야 할 것이다. 본 실험에서는 산성 용액에 대한 pKa 측정을 진행하였으므로, Bromophenol Blue라는 지시약을 사용하였다.
BPB, 브로모페놀 블루 지시약은 브로민이 첨가된 페놀 계열 화합물로, 강한 산성 조건(pH ~3.0)에서는 노란색, 약한 산성 조건(pH 4.6~)에서는 푸른 색을 띄는 지시약이다.
Figure 2. Bromophenol Blue의 pH에 따른 색 변화
브로모페놀 블루 자체의 pKa는 3.85로 Henderson-Hasselbalch 식에 의해 pH가 3.85일 때 노란색과 파란색이 섞인 초록색을 확인할 수 있을 것을 예상할 수 있다.
3. Procedure
3.1 실험 준비물
분광광도계, 큐벳, 시험관, 10mL 부피피펫, 0.05mM 브로모페놀블루(BPB)용액, 0.1N HCl 용액, 0.1N NaOH 용액, 10mM 완충용액 (pH 3.4, 3.7, 4.0, 4.3, 4.6, 7.0)
3.2 실험 방법
3.2.1 브로모페놀블루의 pKa 결정
- 다음과 같이 혼합용액을 준비한다.
혼합용액 1 : 2.0mL 0.05mM BPB 용액 + 2.0mL 0.1N HCl 용액
혼합용액 2 ~ 6 : 2.0mL 0.05mM BPB 용액 + 2.0mL pH 3.4, 3.7, 4.0, 4.3, 4.6 완충용액
혼합용액 7 : 2.0mL 0.05mM BPB 용액 + 2.0mL pH 7.0 완충용액
- a)에서 준비한 혼합용액의 색을 관찰하여 pH에 따라 달라지는 BPB 지시약의 색을 확인한다.
- 분광광도계를 이용하여 넓은 파장대에 대한 혼합용액 1~7의 흡광도를 측정하고, 이 중 450nm~650nm 사이의 영역에 대해 0.5nm 간격으로 측정된 흡광도 데이터만을 추출한다. 혼합용액 1과 7로부터 흡광도가 최대인 파장($\lambda_{max}$)을 결정한다.
- 혼합용액 2~6에 대해서는 위에서 구한 두 $\lambda_{max}$에 대해 흡광도를 읽어 준다.
3.2.2 Beer-Lambert’s Law 확인
- 다음과 같이 혼합용액을 준비한다.
혼합용액 1 : 2.0mL 0.05mM BPB 용액 + 2.0mL 0.1N HCl 용액
혼합용액 2 : 2.0mL 혼합용액 1 + 2.0mL 0.1N HCl 용액
혼합용액 3 : 2.0mL 혼합용액 1 + 2.0mL 혼합용액 2
각 혼합용액에서 BPB의 몰농도는 각각 0.025, 0.0125, 0.0188mM이다.
- 각 혼합용액에 대해서 앞선 실험 3.2.1에서 확인한 두 $\lambda_{max}$에서의 흡광도를 읽어준다.
- 식 (2)에 해당하는 Beer-Lambert 법칙에 b에서의 흡광도 값을 대입하여 식이 성립하는지를 확인한다.
4. Data and Results
4.1 실험 데이터
4.1.1 혼합용액 1, 혼합용액 7의 그래프를 통한 몰흡광계수 분석
Figure. 3, 4. 혼합용액 1과 혼합용액 7의 450~650nm에서의 흡광도 그래프
450~650nm의 파장들에 대한 흡광도 그래프를 그려 보았으며, 흡광도 그래프를 통해 혼합용액 1의 경우 가장 짧은 파장인 450nm에서 최대 흡광도를 가지는 것을, 혼합용액 7에서는 690nm 부근에서 최대 흡광도를 가진다는 사실을 확인하였다. Figure 4의 경우 그래프 만으로 최대 흡광도를 갖는 파장 값을 정확히 알기 힘들기 때문에 data 파일을 통하여 594.09nm에서 최대 흡광도를 가진다는 사실을 파악할 수 있었다. 또한 최대 흡광도인 파장에서의 몰 흡광계수를 구하기 위해 Beer-Lambert 법칙에 각 실험별 최대 흡광도를 대입하여 몰흡광계수를 구할 수 있다.
| 첨가된 용액 | 0.1N HCl | pH 7.0 완충용액 |
|---|---|---|
| 최대 흡광도 | ||
| 파장[nm] | 450 | 594.09 |
| 흡광도(A) | 0.502 | 1.503 |
| 몰흡광계수 | ||
| ($\epsilon$, [M-1cm-1]) | 20080 | 60120 |
undefined Table 1. Acid form의 BPB와 Base form의 BPB에 대한 최대흡광도 파장과 몰흡광계수
Table 1.을 통해 HIn과 In-에 대해 각각의 최대흡수파장과 몰흡광계수를 구하였다.
4.1.2 혼합용액 2 ~ 6에 대한 [HIn], [In-]의 추정
각 pH에서 0.1N HCl과 pH 7.0 완충용액을 넣은 혼합용액 1과 혼합용액 7로부터 구한 최대 흡광도 파장에 대해 그 때의 흡광도를 각각 구하였다.
| Case | 450nm에서 | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 흡광도(A) | [HIn] | |||||
| [mM] | [In-] | |||||
| [mM] | 594.1nm에서 | |||||
| 흡광도(A) | [In-] | |||||
| [mM] | [HIn] | |||||
| [mM] | ||||||
| 2 | 0.45 | 2.24 x10-2 | 2.6 x10-3 | 0.329 | 5.48 x10-3 | 1.95 x10-2 |
| 3 | 0.365 | 1.82 x10-2 | 6.8 x10-3 | 0.548 | 9.12 x10-3 | 1.56 x10-2 |
| 4 | 0.317 | 1.57 x10-2 | 9.3 x10-3 | 0.705 | 1.17 x10-2 | 1.33 x10-2 |
| 5 | 0.268 | 1.33 x10-2 | 1.17 x10-2 | 0.916 | 1.52 x10-2 | 9.8 x10-3 |
| 6 | 0.194 | 9.66 x10-3 | 1.54 x10-2 | 1.149 | 1.91 x10-2 | 5.9 x10-3 |
undefined Table 2. pH에 따른 두 $\lambda_{max}$에서의 흡광도와 그에 따른 화학종의 농도
Table 2를 통해 각 pH별 450nm([HIn])에서의 흡광도와 591.4nm([In-])에서의 흡광도를 각각 알 수 있으며, 이를 통하여 앞선 4.1.1.에서 구한 몰흡광계수를 이용하여 Beer-Lambert 법칙에 적용시킨 결과 위 표와 같은 산 형태의 BPB의 농도와 염기 형태의 BPB 농도를 구할 수 있었다. 또한 투입한 BPB의 몰농도는 모든 경우에 동일하였으므로 산 형태로 존재하는 BPB와 염기 형태로 존재하는 BPB의 몰농도의 합은 강산 상태에서의 [HIn]의 농도, 즉 BPB의 몰농도인 0.025mM과 같아야 한다.
\[\left[HIn\right]_{(init)}=\left[HIn\right]+\left[In^{-}\right]\tag{9}\]식 (9)는 자명하게 성립한다는 사실을 알 수 있다. 이를 이용하여 구한 것이 Table 2에서의 4열과 7열에 해당하는 값들이다. pH 7.0 상태에서도 동일하게 [In-]의 초기농도가 산 형태와 염기형태의 BPB의 몰농도의 합과 같으므로 식 (9)를 동일한 방법으로 적용해주면 된다.
4.2 실험 결과 분석
4.2.1 [HIn]을 통한 pKa의 결정
실험 Data의 4.1.2를 통해 pH에 대해 $log_{10}\frac{[In^{-}]}{[HIn]}$의 그래프를 그려 이를 일차식으로 근사할 수 있다. 이 때 혼합 용액 2~6에서의 pH는 실제 혼합 용액의 pH가 아닌 완충용액의 pH이므로 실제 수소이온의 농도를 다시 계산해 주어야 한다. 물의 자동이온화와 지시약의 변화에 따른 수소이온의 출입을 무시한다면, 단순히 부피가 2배가 되어 수소이온의 몰농도 또한 1/2로 줄었기에 원래의 pH에 $log_{10}2$의 값을 더해 주어야 한다. 이는 0.301이며, 이를 통해 혼합용액 2의 pH는 3.4+0.301 = 3.701과 같이 계산할 수 있다.
Figure 5. 산과 염기 형태 BPB 농도비의 log값에 대한 pH 그래프 (450nm에서의 결과)
Figure 5에서 $log_{10}\frac{[In^{-}]}{[HIn]}$와 pH가 비례함을 알 수 있으며, 그 일차식의 기울기는 1.0781로 Henderson-Hasselbalch 식에서의 이론적 기울기인 1과 유사한 값을 보이는 것을 알 수 있다. 이 때 $log_{10}\frac{[In^{-}]}{[HIn]}$인 지점에서는 pH=pKa가 되는 지점이므로, 내삽을 통해 y절편을 구하면 이는 4.6122이다. 이를 통해 알 수 있는 Ka=$10^{-pKa}$=2.44x10-5 이며, 문헌값인 1.15x10-4 와 비교했을 때 약 -83.8%의 오차를 보였다.
4.2.2 [In-] 을 통한 pKa의 결정
4.2.1.에서와 동일한 방법으로, 이번에는 최대흡수 파장 594.2nm에서 측정된 pH별 [In-]를 이용하여 동일한 방법으로 분석을 진행하였다.
Figure 6. 산과 염기 형태 BPB 농도비의 log값에 대한 pH 그래프(594nm에서의 결과)
4.2.1.에서의 분석 방법과 동일하므로 이는 생략하고 도출된 일차함수를 보면 기울기는 1.168로 앞선 결과보다 조금 더 크게 도출된 것을 확인할 수 있다. 또한 $log_{10}\frac{[In^{-}]}{[HIn]}$가 0인 지점에서의 pH는 4.3335로 pKa가 4.3335로 나왔음을 의미한다. 이 때 Ka = $10^{-pKa}$=4.64x10-5이며, 문헌값과의 오차는 -59.6%로 앞서 [HIn]을 이용한 결과보다 더 정확한 결과를 얻을 수 있었다.
| 데이터 | [HIn]이용(450nm) | [In-]이용(594nm) |
|---|---|---|
| 일차근사 기울기 | ||
| (이론값 : 1) | 1.078 | 1.168 |
| pKa | 4.6112 | 4.3335 |
| Ka | 2.44x10-5 | 4.64x10-5 |
| 오차율(%) | -83.8 | 59.6 |
undefined Table 3. 각각의 농도를 통해 구한 Ka값과 그 오차율 정리
4.2.3 Beer-Lambert 법칙의 실험적 증명
0.025mM, 0.0125mM, 0.0188mM의 BPB 용액을 이용하여 측정한 흡광도 데이터를 이용하여 앞서 구한 $\lambda_{max}$에서의 몰흡광계수를 이용하여 Beer의 법칙을 증명할 수 있다.
| BPB 농도 | 0.025mM | 0.0188mM | 0.0125mM |
|---|---|---|---|
| 흡광도(A) | 0.502 | 0.461 | 0.353 |
| [HIn] (mM) | 0.025 | 0.02296 | 0.01758 |
undefined Table 4. 0.025mM에서의 몰흡광계수를 이용해 구한 [HIn]
Figure 7. Beer-Lambert 법칙을 통해 구한 [HIn]에 따른 흡광도 그래프와 이론값
0.025mM 농도에서의 최대흡수파장인 450nm에서 구한 흡광도를 강산성 환경에서의 [HIn]=0.025mM을 적용하여 몰흡광계수를 앞서 구한 바 있다. 이렇게 구한 몰 흡광계수를 더 낮은 BPB 농도에 대해서도 [HIn]을 구하는데 적용하였다. 즉 흡광도 A에서 몰흡광계수 $\epsilon$를 나누게 되면 b=1cm이므로 HIn의 농도가 도출되는 것이다. pH가 1.3 정도인 강한 산 환경에서는 지시약이 모두 산 형태로 존재할 것이므로 [HIn]의 농도가 BPB의 농도와 동일하게 각각 0.0188mM, 0.0125mM이 도출될 것을 예상할 수 있었다. Figure 7을 보면 흡광도와 HIn의 농도가 어느정도 비례하는 것을 확인할 수 있다(푸른색 점선). 그러나 결과를 통해 알 수 있듯이 Beer-Lambert 법칙에 대입하여 구한 [HIn]은 실제보다 더 큰 쪽으로 오차가 발생하였다.
5. Discussion
5.1 혼합용액 1과 혼합용액 7에서의 최대흡수파장와 몰흡광계수 결정에 대한 고찰
5.1.1 혼합용액 별 존재하는 화학종
혼합용액 1과 혼합용액 7, 0.05mM BPB 용액에 0.1N HCl을 섞은 경우와 pH 7.0인 완충 용액을 섞은 경우는 지시약이 모두 acid form이나 base form의 한쪽 형태로만 존재하도록 지시약의 변색범위보다 더 극단적인 pH 조건을 준 것이라고 할 수 있다. 즉 혼합용액 1에서 BPB는 모두 [HIn] 상태이고, 혼합용액 7에서의 BPB는 모두 [In-] 상태로 가정할 수 있다. 이는 르 샤틀리에의 원리를 생각해보면 쉽게 추론 가능하다. 즉 산성 상태에서는 수용액 속 수소 이온의 농도가 높기 때문에
\[HIn⇌H^{+}+In^{-}\tag{10}\]식 (10)의 반응식으로부터 역반응이 우세하게 진행될 것으로 추측할 수 있다. 반대로 염기 상황에서는 수용액 속 수소 이온의 농도가 낮기 때문에 이러한 변화를 막는 방향인 정방향으로 반응이 진행될 것이다.
5.1.2 반응에서의 화학적 평형을 고려할 경우
본 실험에서는 편의를 위해 극단적 pH 상황에서 모두 한쪽 형태의 지시약으로 변하였다는 가정을 하고 실험을 진행하였다. 그러나 실제로 화학반응에서 반응물과 생성물 중 한쪽 방향으로 모두 진행되는 반응은 존재하지 않는다. 즉 혼합용액 1에서도 [In-]가, 혼합용액 7에서도 [HIn]가 어느정도 존재할 수 있다는 것을 의미한다. 이를 Henderson-Hasselbalch 식을 적용하여 계산해보면,
\[pH=pK_{a}+log_{10}\frac{\left[In^{-}\right] }{\left[HIn\right]}→1.301=3.94+log_{10}\frac{\left[In^{-}\right] }{\left[HIn\right]}\tag{11}\] \[\frac{\left[In^{-}\right] }{\left[HIn\right]}=2.29\times 10^{-3}\tag{12}\]즉 전체 BPB의 0.22%는 $\left[In^{-}\right]$의 상태로 존재함을 시사한다. 같은 방법으로 pH 7에 대해서도 적용해 보면,
\[pH=pK_{a}+log_{10}\frac{\left[In^{-}\right] }{\left[HIn\right]}→7=3.94+log_{10}\frac{\left[In^{-}\right] }{\left[HIn\right]}\tag{13}\] \[\frac{\left[In^{-}\right] }{\left[HIn\right]}=1148.15\tag{14}\]즉 전체의 0.087%는 [HIn] 상태로 존재함을 알려주고 있다. 반응의 평형을 고려하였을 때 이를 무시하였기에 해당 요인 또한 오차의 요인으로 작용할 수 있으며, 각 혼합 용액에 대하여 미량 포함된 화학종의 농도에 의해 파장에서의 흡광도에 어느정도 영향을 받았을 가능성이 존재한다.
5.1.3 몰흡광계수의 결정에서의 오차 요인
어떠한 물질의 몰흡광계수를 결정할 때에는 기본적으로 Beer-Lambert 법칙을 이용하여 동일 pH 조건에서 각기 다른 농도의 용액에 대해 분광광도법을 적용하여 흡광도를 구하고, 흡광도와 용액에 대한 그래프를 그려서 그 기울기를 몰흡광계수로 결정한다. 다양한 몰농도의 용액을 만드는 것은 쉽기 때문에 이러한 방법으로 실험을 진행하면 상당히 정확도 높은 몰흡광계수를 구할 수 있다. 그러나 본 실험에서는 단 하나의 test-case에 대해 Beer-lambert 법칙을 적용하여 몰흡광계수를 알아냈기 때문에 그 값의 정확도나 신뢰도가 상당히 낮은 편에 속한다. 그 증거로 Beer-Lambert 법칙을 증명하기 위해 각기 다른 농도에서 진행한 실험 결과를 보면 경향성 측면에서는 어느정도 맞는 모습을 보이고 있지만 흡광도를 통해 몰농도를 정확히 예측했다고는 말할 수 없을 정도로 다른 기울기를 보이고 있다. 차라리 혼합용액 1에서의 결과만으로 구한 몰흡광계수보다 실험 4.2.3의 Figure 7에서의 푸른색 점선으로 표시된 추세선의 기울기를 몰흡광계수로 선택하는 것이 더 합리적인 방법이라 판단된다.
5.1.4 최대흡수파장의 결정
혼합용액 7에서의 최대흡수파장의 결정에서는, 파장에 대한 흡광도 그래프를 그렸을 때 극값이 0이 되는 지점, 즉 최고점에 대한 파장 값을 최대흡수파장으로 결정하였다. 그러나 혼합용액 1의 경우 450~650nm라는 제약조건에 의해 최대흡수파장을 극값이 아닌 범위의 끝부분인 450nm로 지정하였다. 이는 실제로 혼합용액에서의 최대흡수파장이 아니며, 450~650nm이 아닌 전체 파장대에 대하여 그 peak 지점을 최대흡수파장으로 선택하여 실험을 진행하였다면 조금 더 정확도 높은 결과를 얻었을 것으로 추측된다. 실제로 추론된 pKa와 Ka에 대한 오차율을 보면 [HIn]을 이용한 추론, 즉 혼합용액 1의 최대흡수파장을 이용하여 구한 추론에서 더 큰 오차율을 보였다.
5.2 혼합용액 2~6에서의 실험과 pKa의 결정
5.2.1 지시약을 투입한 후 pH의 변화
혼합용액 2~6의 경우 pH가 각각 3.7~4.6인 완충용액과 0.025mM BPB 용액을 1:1로 섞어 만든 용액이므로 완충용액의 특성에 의해 pH가 크게 변하지는 않았을 것으로 예상되나 지시약 투입후에 pH가 어느정도는 변화하였을 것으로 추측된다. 분석 과정의 4.2.1.에서는 이러한 변화를 어느정도 고려하기 위해 부피가 추가됨에 따라 달라지는 pH를 log2 값을 더해주는 방법으로 어느정도 고려하였다. 그러나 이는 정확한 방법이 아니므로 더 정확히 pH를 알기 위해 pH meter를 이용하여 지시약 투입 후의 혼합용액의 pH를 측정하여 대입한다면 더 정확한 결과를 도출할 수 있을 것이다.
5.2.2 pKa의 결정에서 fitting 된 일차함수의 기울기에 관한 고찰
pKa의 결정 시 각 실험에서의 $log_{10}\frac{\left[In^{-}\right] }{\left[HIn\right]}$와 pH에 대한 그래프를 그려 일차함수로 추세선을 그리고 이 때의 상수항, $log_{10}\frac{\left[In^{-}\right] }{\left[HIn\right]}=0$ 인 지점의 pH를 Henderson-Hasselbalch 식에 의해 pKa로 보았는데, 이 때 추세선에 의해 그려진 일차함수의 기울기가 정확히 1이 아닌 1.078. 1.168임을 알 수 있다. 이는 H-H 식의 이론과는 맞지 않는 기울기로, pH에 따라 $log_{10}\frac{\left[In^{-}\right] }{\left[HIn\right]}$가 정확히 바뀌지 않고 있음을 의미한다. 이는 5.2.1에서 앞서 언급한 pH의 오차에 의한 문제일 수도 있고, 5.1.에서 다룬 [HIn]과 [In-]에 대한 오차에 의한 것일 가능성도 존재한다. 더 정확한 분석을 위해서는 단순히 pH에 대한 $log_{10}\frac{\left[In^{-}\right] }{\left[HIn\right]}$ 값들을 선형회귀하는 것이 아니라 기울기를 1로 고정하고 회귀하여 계산하면 이 때는 H-H 식을 완벽히 만족시킨다는 가정하에 얻어지는 데이터이므로 더 정확한 값이 도출될 가능성이 있다.
6. Conclusion
본 실험에서는 브로모페놀블루라는 지시약을 분광광도계를 이용하여 [HIn], [In-]에 대한 최대 흡수 파장과 몰흡광계수를 결정하였다. 이를 통하여 BPB의 acid form인 [HIn]는 450~600nm 아래에서 450nm에서 최대흡수파장을 가지며 이때 도출된 몰흡광계수는 20080M-1cm-1임을 도출하였다. 같은 방법으로 BPB의 base form인 [In-]는 594nm에서 최대흡수파장을 가지며 이 때의 몰흡광계수는 60120 M-1cm-1임을 구하였다. 이를 이용하여 여러 pH 조건에서의 각 경우에 대해 [HIn], [In-]를 앞서 구한 몰흡광계수를 Beer-Lambert 법칙에 대입하여 구하고, [BPB]= [HIn]+ [In-]라는 식을 이용하여 지시약의 짝염기의 농도 또한 알 수 있었다. 이렇게 구한 두 화학종의 농도의 비율에 log를 취해 Henderson-Hasselbalch 식에 적용하여 최종적으로 브로모페놀블루의 pKa를 4.6122, 4.3335로 구할 수 있었다. 또한 Beer-Lambert 법칙을 실험적으로 증명하기 위해 같은 pH 조건에서 지시약의 농도를 0.0188, 0.0125mM으로 낮추었을 때의 흡광도를 구하여 Beer 법칙, 즉 흡광도와 몰농도가 비례 관계에 있다는 사실을 어느정도 증명할 수 있었다. 또한 실험에 대하여 여러 오차원인과 Discussion을 제시하였는데, 최대흡수파장과 몰흡광계수를 구하는 과정에서 개선할 부분을 지적하였으며, Beer-Lambert 법칙과 Henderson-Hasselbalch 법칙을 완벽히 만족한다는 가정을 하고 식을 구하는 것이 더 효율적이라는 의견을 제시할 수 있었다.
7. Reference
[1] Peter Atkins, Loretta Jones, Leory Laverman, Chemical Principles(7th edition), 김관 외 4인 옮김, 자유아카데미: p 465-475 (2018, Korean ver.).
[2] Peter Atkins, Loretta Jones, Leory Laverman, Chemical Principles(7th edition), 김관 외 4인 옮김, 자유아카데미:p 478(2018, Korean ver.).
[3] IUPAC, Compendium of Chemical Terminology, 2nd ed. (1997) Online Corrected version (2006) “Beer-Lambert Law”
[4] LLC, Foundation Internet services, “Henderson-Hasselbalch equation” (2017) www.merckmanuals.com, 접속일 : 2021. 10.08
8. Assignment
8.1 Beer-Lambert 법칙은 항상 성립하지는 않는다. 성립하기 위한 조건 여러 개 중 두가지를 제시하시오.
- 용액의 농도가 너무 짙지 않아야 한다. 용액의 농도가 짙어지면, 용액 속 화학종 사이의 거리가 너무 짧아지므로 화학종 사이의 전자 분포상태에 영향을 주게 된다. 전자 분포 상태에 영향을 받는다는 것은 빛의 투과에도 영향을 미치게 되므로 편차를 가져오게 된다. 실제로 Beer-Lambert 법칙은 농도와 흡광도가 정비례한다는 법칙이지만, 고농도에서는 농도가 높아도 흡광도가 정비례하지는 않고 조금 더 완만한 그래프를 그리게 된다. 또한 이 법칙을 유도할 때 전제조건으로 모든 용액 속 분자가 빛을 받을 가능성이 동일해야 한다는 조건이 있는데, 실제 용액에서는 분자 자체의 크기에 의해 뒤쪽에 있는 분자들은 가리어져 빛을 받지 못하는 경우가 생긴다. 이러한 이유에서도 용액의 농도가 너무 짙으면 정확도가 높은 결과가 나오기 힘들다.
- 농도의 변화가 빛의 굴절률을 변화시키지 않아야 한다. 농도가 짙어짐에 따라 빛의 굴절률이 달라지는 용액들이 존재하는데, 빛을 통과시켜 실험하는 분광광도계에서 빛이 굴절하면 원래라면 모두 Detector에 도달할 빛들이 다른 곳으로 새어나갈 가능성이 존재한다.
8.2 Henderson-Hasselbalch 식을 유도하시오.
앞서 이론적 배경에서 Henderson-Hasselbalch 식을 유도하였기 때문에 이를 가져왔다.
Henderson-Hasselbalch 식 혹은 헨더슨-하셀바흐 식은 완충용액으로서의 산을 표현하기 위해 만들어진 식으로 기존의 산의 해리상수의 표현식의 양변에 밑이 10인 로그를 취하여 간단히 유도된다.
먼저 산의 해리식은 다음과 같다.
\[HA+H_{2}O⇌H_{3}O^{+}+A^{-}\]이 때의 평형상수는 산해리 상수 $K_{a}$이며, 산해리 상수에 밑이 10인 로그를 취해주면,
\[log_{10}K_{a}=log_{10}\frac{\left[A^{-}\right] }{\left[HA\right]}+log_{10}[H_{3}O^{+}]\]여기서 $-log_{10}[H_{3}O^{+}]$은 pH이므로, 양변에 -1을 곱한다음 좌변에 pH만 남기고 정리해주면,
\[pH=pK_{a}+log_{10}\frac{\left[A^{-}\right] }{\left[HA\right]}=pK_{a}+log_{10}\frac{\left[Base\right] }{[Acid]}\]수소 이온 혹은 하이드로늄 이온 농도에 -log를 취한 것이 pH임을 이용하여 정리하면 위 식과 같이 pH를 pKa와 산, 그 짝염기에 대한 식으로 나타낼 수 있다.
8.3 본 실험에 사용한 지시약은 둘다 triphenylmethane 뼈대를 지닌 지시약이다. 이와 다른 뼈대 분자 구조를 가진 지시약을 하나 찾고, pH 변화에 따른 색과 구조의 변화를 설명하시오.
메틸 레드 (Methyl Red)는 Diazenyl Benzene의 뼈대에 아세트산기와 메틸기를 가진 지시약으로 pH 4.4 이하의 산성에서는 붉은 색, pH 6.2 이상에서는 노란색을 띈다.
Figure 8. 메틸 레드의 지시약으로서의 반응
산성 용액에서는 Figure 8의 우측 상태, 염기성에서는 좌측 상태로 존재하게 되며, 이 또한 르 샤틀리에의 원리에 의해 그 이유는 쉽게 설명 가능하다. 두개의 메틸기와 결합하고 있는 질소에 양성자가 결합하거나 떨어지는 방식이며, 이는 질소 원자 주변의 작용기가 발색단이기 때문에 분자의 광학적 성질을 변화시켜 색이 변하는 것으로 볼 수 있다.